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細胞計數試劑盒(Cell Counting Kit)操作方法
2019.06.27   點擊119次

一、制作標準曲線(測定細胞具體數量時)

1、先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量,然后接種細胞。

2、按比例(例如:1/2比例)依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度,一般要做3-5個細胞濃度梯度,每組3-6個復孔。

3、接種后培養2-4小時使細胞貼壁,然后加CCK試劑培養一定時間后測定OD值,制作出一條以細胞數量為橫坐標(X軸),  OD值為縱坐標(Y軸)的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量(試用此標準曲線的前提是實驗的條件要  一致,便于確定細胞的接種數量以及加入CCK后的培養時間。)

二、細胞活性檢測

1、在96孔板中接種細胞懸液(100μL/孔)。將培養板放在培養箱中預培養(在37℃,5% CO2的條件下)。

2、向每孔加入10 μL的CCK溶液(注意不要在孔中生成氣泡,它們會影響OD值的讀數)。

3、將培養板在培養箱內孵育1-4小時。

4、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

5、如果暫時不測定OD值,打算以后測定的話,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。

三、細胞增值-毒性檢測

1、在96孔板中配置100μL的細胞懸液。將培養板在培養箱預培養24小時(在37℃,5% CO2的條件下)。

2、向培養板加入10μL不同濃度的待測物質。

3、將培養板在培養箱孵育一段適當的時間(例如:6、12、24或48小時)。

4、向每孔加入10μL CCK溶液(注意不要再孔中生成氣泡,它們會影響OD值的讀數)。

5、將培養板在培養箱內孵育1-4小時。

6、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

7、如果暫時不測定OD值,打算以后測定的話,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。

注意:如果待測物質有氧化性或還原性的話,可在加CCK之前更換新鮮培養基(除去培養基,并用培養基洗滌細胞兩次,然后加入新的培養基),去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下,可以不更換培養基,直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。

備注:

① 建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入CCK試劑后的培養時間。

② 有條件的情況下建議采用多通道移液器,可以減少平行孔減的差異。加入CCK試劑時,建議斜貼著培養板壁加,不要插到培養基頁面下加,容易產生氣泡,會干擾OD值讀數。

③ 白細胞可能需要培養較長時間。

④ 當使用標準96孔板時,貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μL 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μL 培養基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗,請先計算每孔相應的接種量,并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK溶液。

 ⑤ 如果沒有450nm的濾光片,可以使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片,但是450nm濾光片的檢測靈敏度最高。                              

 ⑥ 培養基中酚紅的吸光度可以在計算時,通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不會對檢測造成影響。

活力計算:

細胞活力*(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)] ×100

A(加藥):具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度

A(空白):具有培養基和CCK溶液而沒有細胞的孔的吸光度

A(0加藥):具有細胞、CCK溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度

* 細胞活力:細胞增殖活力或細胞毒性活力

1.一個孔中應接種多少個細胞當使用標準96孔板時,貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μl 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μl 培養基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗,請先計算每孔相應的接種量,并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。

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